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Lise ist ein griechisches Wort und bedeutet einfach "teilen" oder "zersetzen". Es ist eine gute Beschreibung der Reaktion, die mit Zellen in einem Lysepuffer auftritt, einer Lösung, die sie zerlegt, um ihren Inhalt zu extrahieren. Wissenschaftler verwenden diese Lösungen, um DNA oder Proteine in der Zellanalyse zu extrahieren, insbesondere bei Bakterien. Die Art des Zelllysepuffers variiert je nach Art des Experiments, wir werden jedoch einige gebräuchliche Optionen erwähnen.
Puffer und Salz
Die Pufferlösungen stabilisieren den pH-Wert, während die Zellen den Lyseprozess durchlaufen. Die Tris-HCL-Lösung ist der häufigste Puffer zum Puffern bei pH 8, wenn der pH-Wert gewünscht wird. HEPES ist eine weitere übliche Pufferlösung in diesen Experimenten. Natriumchlorid kann auch zugesetzt werden, um die Ionenstärke, die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe außerhalb der Zellen, zu erhöhen. Letzteres ist wichtig, da sich Wasser auf alle Zellmembranen ausbreiten kann, von Regionen mit niedriger Konzentration an gelösten Stoffen bis zu Regionen mit hoher Konzentration.
Waschmittel
Waschmittel ist der Hauptbestandteil, der die Zellmembran auflöst, so dass der Inhalt entweichen kann. Waschmittel sind amphipathische Moleküle, dh ein Ende, das leicht mit Wassermolekülen interagiert, während das andere hydrophobe Ende oder "das Angst vor Wasser hat" diese Interaktion nicht durchführt. Sie können Fette auflösen, indem sie Mizellen bilden, kleine Gruppen, in denen die hydrophoben Schwänze der Waschmittelmoleküle nach innen zu den Fettmolekülen zeigen. Übliche Waschmittel sind Natriumdodecylsulfat oder SDS, NP-40 und TritonX.
Chelatbildner und Inhibitoren
Lysepuffer enthalten üblicherweise auch Chelatbildner wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Retylenglykoltetraessigsäure (EGTA). Diese Chemikalien binden mit einer Ladung von +2 an Metallionen (z. B. Magnesium und Calcium) und sind daher für andere Reaktionen nicht verfügbar. Viele DNAses (Proteine, die DNA kauen) und Proteasen (Proteine, die andere Proteine schneiden) benötigen Magnesiumionen, um zu wirken. Indem sie ihnen diesen Hauptbestandteil, EDTA und EGTA, entziehen, tragen sie dazu bei, den Protease- oder -spiegel zu senken der DNAse-Aktivität. Sie schließen sie jedoch nicht vollständig aus, und einige Proteasen hängen nicht von Magnesium-Cofaktoren ab. Daher enthalten Lysepuffer manchmal auch Substanzen, die als Proteaseinhibitoren bezeichnet werden, die daran binden und deren ordnungsgemäße Wirkung verhindern.
Alkalische Lyse
Die alkalische Lyse ist eine sehr verbreitete Technik zur Reinigung von Plasmiden von Bakterien. Diese Methode impliziert die Verwendung von drei Lösungen. Die erste enthält Glucose, Tris-HCL-Puffer, EDTA und RNAs. Glukose erzeugt eine hohe Konzentration an gelöstem Stoff außerhalb von Bakterien, so dass diese leicht schlaff werden und den Lyseprozess erleichtern. EDTA und Tris-HCL funktionieren wie zuvor beschrieben, während RNAse jede RNA in der Zelle kaut, um sie aus dem Weg zu räumen. Die zweite Lösung führt effektiv eine Zelllyse durch. Es enthält das Detergens SDS und NaOH, das den pH-Wert auf 12 oder mehr erhöht, die Proteine in der Zelle denaturiert und bewirkt, dass sich die DNA in einfache Filamente trennt. Die dritte Lösung enthält Kaliumacetat, um den pH-Wert auf ein neutraleres Niveau zu bringen, so dass die Plasmid-DNA-Stränge zusammenkommen können. Währenddessen kommen die denaturierten Proteine zusammen und fallen aus, während sich die Dodecylsulfationen mit den Kaliumionen zu einer unlöslichen Verbindung verbinden, die auch aus der Lösung ausfallen kann.