Wie macht man Agarosegelen?

Video: Wie funktioniert DNA-Analyse? - Gel-Elektrophorese einfach erklärt!

Inhalt

Anweisungen
Zubereitung des Agarosegels
Hinweis
Was du brauchst

Agarose-Gele werden von Wissenschaftlern in molekularbiologischen Laboren hergestellt, um DNA-Fragmente zu untersuchen, die während experimenteller Arbeiten modifiziert werden. Die Technik der Agarosegelherstellung ist eine grundlegende Routine, die von allen Forschern beherrscht werden muss, da sie die direkte Anzeige verschiedener DNA-Größen für Verifikations- und Genklonierungsprojekte ermöglicht. Obwohl die Gelvorbereitung wie bei allen Laborverfahren nicht schwierig ist, sollte sie nur von einem Fachmann ausprobiert werden, der aufgrund der damit verbundenen biologischen Risiken wissenschaftlich ausgebildet ist.

Anweisungen

Wie macht man Agarosegelen? (Comstock Images / Comstock / Getty Images)

Zubereitung des Agarosegels

Stellen Sie sicher, dass die Gelbasen keine Risse aufweisen oder etwas, das dazu führen könnte, dass heiße Agarose ausläuft. Schalen mit 70% igem Alkohol reinigen und vollständig trocknen lassen. Die Basis hat zwei offene Enden und zwei geschlossene Enden. In einigen Formaten werden Klammern mitgeliefert, um die Enden zu schließen. Die meisten müssen jedoch versiegelt werden, indem Bandstreifen zwischen die offenen Teile gelegt werden. Drücken Sie das Klebeband fest und fest an, da es sich möglicherweise vom Halter entfernen und heiße Agarose auslaufen lässt.
Bestimmen Sie anhand der Größe des DNA-Fragments, das auf Agarosegel aufgetrennt und analysiert werden soll, den geeigneten Prozentsatz, der benötigt wird. Bei 1% (Gew./Vol.) Ist das Agarosegel beispielsweise für die Analyse von 0,5 bis 10 kb DNA-Segmenten wirksam. Je höher der Prozentsatz (mehr Agarose), desto kleiner können die Fragmente getrennt werden. Routineexperimente verwenden einen Bereich von 0,5% bis 2% Agarose. Für 1% Agarosegel wiegen Sie 1 g Agarosepulver in einem chemischen Verband oder einem anderen Einschlusssystem. Vorsichtig in den Laborvorbereitungsbereich des Gels übertragen.
Messen Sie im entsprechenden Gelvorbereitungsbereich 100 ml Elektrophoresepuffer. Es sollte bei Raumtemperatur sein. Übertragen Sie das Agarosepulver in einen feuerfesten Kolben und gießen Sie das abgemessene Volumen Elektrophoresepuffer. Erwärmen Sie die Mischung vorsichtig in einem Mikrowellenofen, kochen Sie sie jedoch nicht, da Verdampfung den Prozentsatz der vorhandenen Agarose verändern kann. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Agarose aufgelöst ist, schütteln, um gründlich zu mischen, lassen Sie etwas abkühlen und geben Sie dann 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid hinzu. Atmen Sie keinen Dampf ein, da dies die Lunge und das Schleimhautgewebe reizen kann. Erhitzen Sie die Lösung auch nicht, nachdem das Ethidiumbromid hinzugefügt wurde. Zum Mischen erneut schütteln und dann, während die Lösung noch heiß genug ist, um verschüttet zu werden, diese in die vorbereitete Basis geben. Wenn ein großes Probenvolumen oder eine geringe DNA-Konzentration vorhanden ist, kann ein dickeres Gel hergestellt werden. Die feineren Gele sind jedoch leichter zu analysieren, da sie klarer fotografiert werden.
Setzen Sie die Kämme in das Gel ein, um Rillen oder Vertiefungen für die zu platzierende Probe zu schaffen. Lassen Sie es mehrere Stunden auf Zimmertemperatur oder einige Minuten im Kühlschrank abkühlen. Im letzteren Fall sollte die Anwesenheit von Agarose-Kristallen beobachtet werden, sobald das Gel fertig ist. Im Allgemeinen verschwinden sie, wenn das Gel vor der Verwendung einige Minuten auf einer Arbeitsplatte auf Raumtemperatur erwärmen gelassen wird. Entfernen Sie vorsichtig die Kämme, um das Gel nicht zu zerreißen oder die Wells zu brechen. Das Agarosegel ist jetzt gebrauchsfertig. Wenn es nicht sofort verwendet wird, muss es in Zellophan verpackt oder in einem Kunststoffbehälter im Kühlschrank aufbewahrt werden, um ein Austrocknen oder Schmelzen zu verhindern.

Hinweis

Die verwendeten Reagenzien sind möglicherweise krebserregend und sollten mit Vorsicht und angemessenem Schutz behandelt werden. Wenn während der Zubereitung des Gels ein Fehler begangen wird, sollte es niemals erneut erhitzt werden, sondern beseitigt und ein neues Gel erneut hergestellt werden.