Inhalt
- Erkennung anhand von Farbänderungen
- Verwendung eines ELISA-Readers zur Messung
- Direkter kompetitiver ELISA (Cytochrom c)
- Inkubieren Sie den primären Antikörper in Röhrchen
Der ELISA-Test ist ein Enzym-gebundener Immunosorbent-Assay, bei dem Antikörper oder Antigene verwendet werden, die an ein bestimmtes Enzym gekoppelt sind, um die Antikörper- oder Antigenkonzentration zu bestimmen. Wenn Sie einen ELISA einnehmen und keine spezifischen Antikörper verwenden können, um Ihre Ergebnisse zu erhalten, wird ein kompetitiver ELISA empfohlen, da er ein Antigen verwendet, das an ein Enzym anstelle des Antikörpers konjugiert ist, und eine andere Nachweismethode verwendet.
Erkennung anhand von Farbänderungen
Ein übliches Protokoll für den kompetitiven ELISA ist die Verwendung eines nicht markierten und gereinigten primären Antikörpers. Der Antikörper bedeckt die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte und wird mit unbekannten Standards inkubiert. Anschließend wird ein Immunogen hinzugefügt, um mit dem primären Antikörper zu konjugieren, der an die noch nicht besetzten Antikörperstellen bindet. Ein Substrat wird dann verwendet, um eine Farbänderung zum Messen der Bindungskonzentration zu erzeugen.
Verwendung eines ELISA-Readers zur Messung
Verwenden Sie eine Mikrotiter-Polystyrolplatte und geben Sie den primären Antikörper in jede Vertiefung. Um eine maximale Bindung zu erreichen, füllen Sie die Vertiefung mit einem Mikrogramm des Antikörpers. Die Platte vier Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren. Füge den primären Capture-Antikörper hinzu und wasche die Vertiefungen mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung). Platten mit Blockierungspuffer zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Vertiefungen noch zweimal mit PBS und fügen Sie die Standards hinzu. Legen Sie die Antigen-Konjugat-Lösung in die Vertiefungen und inkubieren Sie sie erneut für zwei Stunden. Waschen Sie die Platte erneut viermal mit PBS. Fügen Sie das Substrat hinzu und messen Sie die Dichten bei der spezifischen Wellenlänge mit einem ELISA-Lesegerät.
Direkter kompetitiver ELISA (Cytochrom c)
Für einen direkten kompetitiven ELISA muss eine Serumverdünnungsanalyse für das im Experiment verwendete Antigen durchgeführt werden. Die Mikrotiterplatte wird dann mit Cytochrom c beschichtet und über Nacht inkubiert. Der ELISA-Teil des Assays wird dann durch Zugabe von Blockierungsreagenz und sekundärem Antikörper durchgeführt. Die Extinktionsergebnisse werden mit einem Mikroplattenleser gelesen.
Inkubieren Sie den primären Antikörper in Röhrchen
Bei diesem Verfahren wird der primäre Antikörper in Reagenzgläsern inkubiert, in denen das interessierende Antigen daran bindet. Die Proben werden dann in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben und inkubiert. Die Vertiefungen werden dann gewaschen, um nicht gebundene Antigen-Antikörper-Komplexe zu entfernen, und dann wird die Blockierungslösung zugegeben, um zu verhindern, dass der zweite Antikörper an die Vertiefungen bindet. Der sekundäre Antikörper wird dann auf einem Plattenlesegerät gelesen, um die Ergebnisse zu erhalten.